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Anti-Flag亲和凝胶

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B23101	1 mL Kit	RMB 1894.18
B23102	5 mL Kit	RMB 7900.63

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Customer Product Validation(13)

Co-immunoprecipitation assay was performed to prove the interaction of FUZ and BNIP3. A549 cells were transfected with Flag-FUZ and BNIP3-His plasmids. Flag-RIOK plasmid was used as negative control.
Data from Biomedical Research Foundation of the Academy of Athens
Data from Shanghai Center for Systems Biomedicine
Bimake Anti-Flag Affinity Gel displays an advantage over Sigma ANTI-FLAG M2 Affinity Gel in FLAG-tagged protein binding capacity.
Cell line: Protein-FLAG (85 kD) overexpressed HEK293T
1 1% Input,
2 Bimake Anti-Flag Affinity Gel,
3 Bimake Anti-Flag Affinity Gel + IP,
4 Sigma ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel + IP
Data from Lab of Professor Dahua Chen,Institute of Zoology,CAS
Data from Washington University in St. Louis School of Medicine
Red arrow shows the target protein in elution.
TEV is a protease which is frequently used for the controlled cleavage of fusion proteins in vitro and in vivo.
Data from National Center for Protein Science Shanghai
Cell line: Protein-FLAG (90 kD) overexpressed HEK293T
1 ANTI-FLAG Affinity Gel + IP (Protein-FLAG (90 kD) overexpressed HEK293T)
2 ANTI-FLAG Affinity Gel + IP (HEK293T)
Cell line: Protein-FLAG (90 kD) overexpressed HEK293T
1 Sigma ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel
2 Sigma ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel + IP
3 Bimake Anti-Flag Affinity Gel
4 Bimake Anti-Flag Affinity Gel + IP
Cell line: Protein-FLAG (40 kD) overexpressed HEK293T
1 2% Input,
2 Bimake Anti-Flag Affinity Gel,
3 Bimake Anti-Flag Affinity Gel + IP,
4 Sigma ANTI-FLAG® M2 Affinity Gel + IP
a, HEK293T cells were co-transfected with relevant plasmids, cells were collected at 48 h after transfection and immunoprecipitated with anti-Flag gel (Bimake, B23101). “*” non-specific bands. b, HEK293T cells co-transfected with GFP-SUMO1 or its SUMOylation mutant and Flag-α-catenin. Cell extracts were inmmunoprecipitated with Flag gel described in a.
(A) Anti-Flag resin pull down of mEphA4^LBD and untagged zRET^ECD with immobilized zefn-A5^ECD. The black arrows in Lanes 3 and 8 point to the mEphA4^LBD pulled down by zefn-A5^ECD. (B) Protein G bead pull down of zRET^ECD and zefn-A5^ECD with immobilized mEphA4^LBD. The black arrows in Lanes 1 and 4 mark the zefn-A5^ECD pulled-down by mEphA4. Molecular weight standards: PageRuler Plus standard protein ladder in Lanes 1(A) and 2(B). PD: samples eluted from the beads after pull down. Lanes without the PD label contain input protein samples as indicated.

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产品描述

Bimake Anti-Flag Affinity Gel 由高质量的鼠源 IgG2b 单克隆抗体与sepharose 4B gel 通过共价偶联制备，本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量（至少为1.1mg protein /ml gel），杂蛋白非特异结合少，可用于蛋白质免疫共沉淀和少量蛋白质纯化。

产品性质

抗体克隆号	1E6
抗体亚型	鼠源IgG2b
抗体纯化方法	Protein A 纯化制备
抗体结合量	7.5 克抗体/升gel
适用范围	蛋白质免疫共沉淀，蛋白质纯化
推荐使用体积	蛋白质免疫共沉淀: 500μl 细胞裂解液使用 5μl gel
融合蛋白结合容量	至少为1.1mg protein/ml gel
结合特性	甲硫氨酸修饰的N端Flag融合蛋白：Met-FLAG–Protein N端Flag 融合蛋白：FLAG–Protein C端 Flag 融合蛋白：Protein-FLAG
运输条件	4°C 冰袋

产品储存溶剂

Bimake Anti-Flag Affinity Gel 储存溶剂：10 mM Na3PO4, 150 mM NaCl, 50% 甘油, pH 7.4，含有0.02%（w/v）叠氮化钠。

储存条件

未开封的产品可在-20℃稳定保存2年。使用后需保存在储存溶剂（50%甘油，10 mM Na3PO4，150 mM NaCl，0.02%叠氮化钠，pH7.4）中并且禁止在不含甘油的溶剂中冻存。

操作步骤

凝胶预处理
1、轻微重悬Anti-Flag Affinity Gel使均一，迅速转移10 μL混合液（约5 μL纯胶）至新的离心管中。
2、加入500 μL TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)，轻轻混匀，5,000 rpm离心30s，弃上清，重复上述步骤3-4次。
样本的结合
3、上述的凝胶中加入50-200 μL细胞裂解液，然后室温孵育2 h或4 ℃条件下过夜。
4、5,000 rpm离心30s，将上清液转移到新的离心管中备用（上清液可用于检测Flag-tag蛋白是否存在残留）。
洗涤
5、向上述沉淀中加入500 μL PBST（NaCl 136.89 mM; KCl 2.67 mM;Na2HPO4 8.1 mM; KH2PO4 1.76 mM；0.5% Tween20），用移液器轻柔地吹打重新分散凝胶，然后上下翻转样品5 min。5000rpm离心30s，弃上清。
6、重复上述步骤两次。如遇到非特异性杂蛋白去除不干净的情况，请延长清洗时间、增加清洗次数或适当增加清洗液中去垢剂的含量。
洗脱
根据下游用途选择不同的洗脱方法，进行免疫共沉淀可直接进行7-8步；进行蛋白纯化可根据后续实验，选择多肽竞争性洗脱（9-10步）或low pH洗脱（11-12步）

变性洗脱（适用于利用Anti-Flag Affinity Gel进行免疫共沉淀实验）：
7、对于直接检测目的蛋白的情况，在上述所得沉淀中加入50 μL 1×蛋白上样缓冲液，煮沸5 min，冷却至室温并离心。
8、取上清进行SDS-PAGE检测。

Poly FLAG多肽竞争性洗脱（适用于利用Anti-Flag Affinity Gel进行蛋白纯化实验）：
9、将含有200 ug-1 mg/ml Poly Flag多肽(B23111)的TBS缓冲液加入步骤6的产物中，Poly FLag多肽缓冲液体积为凝胶使用量的5倍，4℃摇床孵育洗脱2 hour（为了提高洗脱效率，可延长孵育时间或重复洗脱）
10、将上述步骤得到的产物进行离心（5000rpm，30s），将包含目的蛋白的上清转移到新的EP管中。凝胶如需重复使用，需用0.1M glycine HCl（pH 3.0）进行清洗后再回收。

低pH洗脱（适用于利用Anti-Flag Affinity Gel进行蛋白纯化实验）：
11、将0.1M glycine HCl（pH 3.0）洗脱液加入步骤6中的产物中，洗脱液体积为凝胶使用量的5倍，摇床孵育洗脱5min，洗脱时间不得超过20 min。
12、将上述产物进行离心（5000rpm，30s），将洗脱产物立即加入1M Tris（pH 8.0）进行中和，并调节pH直至中性。